VESCICOLE SINAPTICHE
STUDIATE IN NANOSCALA
Impiegando una nuova metodica di visualizzazione
microscopica nota come stimulated emission depletion (STED), Hell, Jahn e collaboratori hanno studiato
il processo di riciclo delle vescicole sinaptiche, superando i consueti limiti
di risoluzione delle microscopia ottica a fluorescenza. La ricerca, condotta
presso il Dipartimento di Nano-Biofotonica dell’Istituto Max Plank per la
Chimica Biofisica di Gottingen, ha prodotto risultati di grande rilievo che
certamente incoraggeranno l’impiego di questo metodo in molti altri studi (Willig K. I., et al. STED microscopy reveals that synaptotagmin
remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature 440, 935-939,
2006).
L’osservazione mediante tecniche di microscopia ottica si ferma ad una risoluzione che corrisponde a metà della più corta lunghezza d’onda della luce visibile (circa 200 nanometri); Stefan Hell e Reinhard Jahn hanno realizzato la loro tecnica di microscopia STED (si veda: Simpson G. J., The diffraction barrier broken, Nature 440, 879-880, 2006) per superare tale “barriera di diffrazione”. Aggiungendo un raggio-STED ad un raggio eccitatorio, restringono la fluorescenza di un ordine di magnitudo al di sotto del limite di diffrazione nel punto focale al centro del raggio eccitatorio. Ne risulta un aumento della risoluzione fino a 40-70 nm, con la conseguente possibilità di visualizzare organuli delle dimensioni delle vescicole sinaptiche.
In questo primo impiego della metodica, si è tentato di dare risposta all’annoso interrogativo sulla natura del meccanismo di riciclo delle vescicole sinaptiche. E’ infatti ancora incerto se dopo l’esocitosi avvenga una completa fusione fra membrana vescicolare e membrana plasmatica determinando la scomparsa della vescicola, o se questa si apra in corrispondenza del punto di fusione con la zona attiva della membrana sinaptica, per poi richiudersi dopo l’emissione del neuromediatore, come fosse un contenitore pronto per essere nuovamente riempito.
Per la verità molti studi recenti hanno già affrontato la questione e, nel caso del “kiss and run”, sembra vi sia una chiara risposta (si veda: Note e Notizie 11-03-06 Una nuova tecnica per studiare il “kiss and run”), tuttavia non era stato ancora possibile studiare il processo a questo livello di risoluzione spaziale, che ha consentito uno straordinario accertamento de visu di quanto accade dopo il rilascio del neurotrasmettitore nello spazio intersinaptico.
Gli autori hanno evidenziato mediante un anticorpo fluorescente la sinaptotagmina I, proteina specifica della vescicola sinaptica, per seguirne il destino: se durante il processo di riciclo fosse rimasta localizzata nel punto di esocitosi, l’ipotesi secondo cui il granulo si svuota sarebbe stata confermata, se invece si fosse distribuita nella membrana presinaptica, come normalmente accade alle proteine nella fusione delle membrane, si sarebbe potuta sostenere la scomparsa della vescicola e la necessità della sintesi ex-novo.
Le immagini riprese durante il riciclo hanno chiaramente mostrato la sinaptotagmina localizzata in corrispondenza della zona attiva della membrana presinaptica.
Ripetendo gli esperimenti dopo intensa stimolazione del terminale sinaptico si sono avuti gli stessi risultati.
Si può concludere che le vescicole non sembrano perdere l’integrità strutturale e, sebbene siano necessarie ulteriori verifiche e conferme, questa modalità di riciclo sembra sufficientemente provata dalle immagini che corredano la pubblicazione del lavoro. In altre parole non ci sembra azzardato affermare che, allo stato attuale delle evidenze sperimentali, è la modalità di esocitosi mediante fusione completa e scomparsa del granulo a richiedere prove più sicure a supporto del suo effettivo impiego nella trasmissione sinaptica.
E’ d’obbligo una considerazione sulla metodica di microscopia STED: è facile prevedere che avrà numerose ed importanti applicazioni nello studio delle strutture cellulari in generale e delle sinapsi in particolare, anche in considerazione del fatto che può giungere ad un grado di risoluzione più elevato di quello impiegato in questo studio.
L’autrice della nota ringrazia Giuseppe Perrella che
ha presentato il lavoro qui recensito al Seminario Permanente sulle Sinapsi di “Brain
Mind & Life”, discutendo i risultati e le implicazioni. In quella sede, Diane
Richmond ha proposto un ottimo studio di confronto della STED con la
microscopia confocale, studio che, inizialmente, si prevedeva di riassumere in
questo contesto, ma purtroppo l’eccessivo tecnicismo e il carattere super-specialistico
ne hanno reso impossibile una sintesi chiara in uno spazio tanto breve: l’autrice
della nota se ne scusa con la collega Richmond. Infine, ringrazia Isabella Floriani per la correzione della
bozza.