UN NUOVO METODO DI
STUDIO DEL CERVELLO
Per studiare su ampia scala le connessioni fra le
cellule che costituiscono l’encefalo, Livet e i suoi collaboratori dell’Università
di Harvard hanno elaborato un metodo, battezzato “Brainbow”
(da brain = cervello e rainbow = arcobaleno), che consente di
individuare e separare le singole cellule dalle loro vicine per effetto dell’assunzione
di un colore caratterizzante, scelto a caso da un pool cromatico (Livet J., et al. Transgenic strategies for combinatorial
expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature 450, 56-62,
2007).
La procedura non è certo semplice, ma ha dato risultati straordinari consentendo, ad esempio, di distinguere i dendriti e l’assone di ciascun neurone da tutti quelli delle cellule nervose vicine, e rendendo possibile lo studio delle interazioni cellulari anche nelle aree più densamente stipate di neuroni.
La ricerca aveva da tempo l’esigenza di seguire il filo dei collegamenti che, dalla scelta di una fra due cellule, giunge a legarne centinaia, migliaia o milioni, per un singolo evento funzionale. Citando il nostro presidente: “Le estese connessioni fra piccole e grandi reti di neuroni, indicate dai neurobiologi col termine inglese connectivity, costituiscono la trama anatomica che custodisce il segreto funzionale più inaccessibile del nostro sistema nervoso [...] decifrando il senso dei loro rapporti comprenderemo i principi e i criteri di una microfisiologia ancora sconosciuta e spesso forzata a modelli macrofunzionali con esiti infruttuosi”(Giuseppe Perrella, Il cervello di Einstein, BM&L 2004).
I metodi e le procedure attualmente in uso per lo studio morfo-funzionale dei collegamenti, presentano notevoli limiti. Con i metodi di colorazione, ad esempio, si possono evidenziare solo poche cellule per volta e, nel riconoscimento basato sull’espressione di proteine fluorescenti, si sacrifica la maggior parte della struttura cellulare che non è visualizzata (alta sensibilità molecolare, bassa risoluzione strutturale). Anche le ricostruzioni della “connettività” mediante microscopia elettronica tridimensionale presentano limiti legati al metodo e sono ristrette all’area inclusa nella sezione, che spesso si rivela poco significativa.
Brainbow è un set di procedure genetiche che ha consentito agli autori di generare topi transgenici esprimenti fino a 100 tinte diverse nelle cellule del nevrasse.
Nei Transgeni Brainbow, la ricombinazione Cre/lox è usata per creare una scelta stocastica di espressione fra tre o più proteine fluorescenti. L’integrazione di copie in tandem di Brainbow in topi transgenici, ha portato all’espressione combinatoria delle proteine fluorescenti, dalla quale sono derivate innumerevoli tinte.
I ricercatori hanno testato le potenzialità di questo nuovo metodo in varie applicazioni, cominciando dal cervelletto.
In un piccolo volume di tessuto di un lobo cerebellare hanno ricostruito centinaia di assoni fra loro adiacenti, distinguendo le appartenenze dei loro contatti sinaptici multipli, grazie alle evidenti differenze conferite da circa 90 colori diversi. Studiando le connessioni nello strato granulare interno della corteccia cerebellare, hanno dimostrato che ciascuna cellula granulare post-sinaptica riceve inputs sinaptici da numerose fibre muscoidi, originate da altrettanti neuroni pre-sinaptici. Tale dimostrazione rappresenta una risposta sperimentale definitiva ad un problema rimasto insoluto da decenni.
Dopo aver rilevato che alcune linee di topi transgenici esprimevano Brainbow negli astrociti, Livet e colleghi hanno intrapreso uno studio dei rapporti fra neuroni e glia nel cervelletto. Un esito rilevante di questa sperimentazione è costituito dall’aver scoperto che la stessa sezione di un albero dendritico di una cellula di Purkinje è rivestita da prolungamenti provenienti da cellule di Bergmann diverse; queste estensioni gliali formano guaine che si interdigitano numerose volte fra loro.
Un’altra serie di esperimenti interessanti (time-lapse studies) sono stati condotti su cellule di Schwann esprimenti Brainbow nella giunzione neuromuscolare di topo adulto. E’ risultato che la guaina mielina è dinamica, movendosi avanti e indietro lungo il terminale sinaptico.
Un dato interessante, confermato da tutta la sperimentazione di questo metodo, è rappresentato dalla stabilità dei colori che etichettano le cellule per un tempo notevolmente protratto. Questa proprietà consentirà di usare Brainbow in vivo per studi longitudinali di circuiti e di interazioni fra reti neuroniche.
Oltre alla definizione delle mappe dei territori gliali, alla possibilità di seguire l’evoluzione delle interazioni e gli spostamenti di glia e neuroni nel tempo, numerose altre applicazioni potranno essere sviluppate in futuro, e le potenzialità di Brainbow, scegliendo geni promotori e proteine fluorescenti diverse, così come combinandolo con altre tecniche, potranno essere ulteriormente estese.
L’autrice della nota ringrazia la dottoressa
Floriani per la correzione della bozza. L’illustrazione di copertina presenta l’immagine
speculare di due neuroni di Purkinije evidenziati con una procedura ordinaria. L’ottima
risoluzione della singola cellula vuol dire, in questo caso, la perdita della
morfologia degli elementi cellulari circostanti; Brainbow consente di
superare questo limite.